中科院天工所开发无细胞合成维生素B12

来源:By Eric Zhang     2023-09-04 13:36:55

维生素B12(钴胺)在细胞代谢,特别是DNA合成、甲基化和线粒体代谢中起着重要作用。维生素B12是一种必需的维生素,5’-脱氧腺苷钴胺(AdoCbl)和甲钴胺(MeCbl)是维生素B12的天然生物活性形式,氰钴胺(CNCbl)是工业生产的稳定形式,羟钴胺(OHCbl)是一种水合物,它是由AdoCbl中的Co-C键断裂而产生的。然而,由于化学合成过程复杂困难,目前维生素B12的生产一直依赖于微生物的发酵。尽管微生物的发酵产生高滴度的维生素B12,但其发酵过程较长,基因工程工具有限,阻碍了进一步的改进。无细胞酶体系是代谢工程的一种新兴选择,因为与微生物发酵相比,级联催化可以提供明显的优势。然而,由于合成路线较长,目前还没有实现钴胺的无细胞合成,仅有少数几个中间体的酶促合成报道。

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1钴胺生产的无细胞合成系统

中科院天津工业生物技术研究所张大伟教授团队和韩国高级科学技术研究院化学与生物分子工程系Sang Yup Lee教授团队,在Nature Communications》杂志发表了题为“A synthetic cell-free 36-enzyme reaction system for vitamin B12 production”的研究论文。论文报告了一种合成AdoCbl的方法,该方法基于由廉价化合物5-氨基酮丙酸(5-ALA)进行级联催化反应的无细胞反应系统。整合和优化了30多个生物催化反应,克服了反馈抑制、中间产物检测复杂、中间产物不稳定以及辅因子的不平衡和竞争等问题,实现了AdoCbl的完全无细胞合成。最终,该无细胞体系分别以5-丙氨酸和氢化铋为底物生产了417.41μg/L5.78 mg/LAdoCbl。这种协调复杂无细胞系统合成模块的策略将促进开发无细胞平台来生产具有长而复杂生物合成途径的天然化合物。

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图2、标准吉布斯自由能在整个AdoCbl合成途径中发生的变化

研究人员首先对AdoCbl的合成进行设计。研究者对热力学特性和中间产物的检测进行考虑,将整个合成途径被分为五个模块(即前体模块、HBA模块、AdoCby模块、AdoCbl模块和辅因子再生模块),以分别进行实施和优化。为了实现这一目标,研究者选择并组装了由来自不同微生物的26种合成酶催化的24个反应,并计算或查询了每个反应的热力学参数。

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图3、前体模块中的死端副产物尿卟啉III

接下来,研究人员对前体模块进行了优化。在前体合成模块中,85-ALA分子在胆红素原合成酶(HemB)、胆红素原脱氨酶(HemC)、尿卟啉原-III合成酶(HemD)和尿卟啉生成III甲基转移酶(COBA)的催化下组装成一个前角蛋白-2(Pre-corrin-2)并伴随一种未知的红棕色中间体产生。经LC-MS鉴定,该红棕色副产物为尿卟啉III(Uro III)、氧化形式的尿卟啉III(Ugen III)。为了减少Ugen III的氧化,在前体合成反应体系中加入了添加2%(v/v)β-巯基乙醇,成功解决了前体合成模块中的瓶颈。

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4HBA模块的无细胞合成

在此之后,研究人员对HBA模块进行了优化。研究人员首先构建了含有人工cob操纵子的pET28a衍生质粒的大肠杆菌(HBA1),该菌株可产生将前角蛋白-2转化为HBA8个酶。由于大肠杆菌的内源酶CysG会影响反应,因此构建了不同的从HBA1衍生的完全或部分敲除CysG操纵子的菌株作为HBA模块的粗细胞提取物来源,并成功提升了粗细胞提取物中HBA的产率。在上述HBA合成反应系统中SAH对甲基转移酶的累积反馈抑制被认为是多重转甲基化HBA合成途径的一个严重的潜在障碍。为了解除抑制,MtnN被用来通过去嘌呤从反应体系中去除SAH,并利用蛋氨酸腺苷转移酶MetK及等摩尔量的L-蛋氨酸取代SAM作为甲基供体,成功解除了反馈抑制。最后,研究人员还对pH值条件进行了优化,成功提高了HBA的滴度。

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5HBA合成模块优化

研究人员进一步对AdoCby模块进行优化。在前期实验中研究人员检测到一株产维生素B12工程菌体内HBA的积累,推测HBA合成HBAD的反应在建立无细胞反应体系的初期是一个瓶颈反应。因此其对HBA转化为HBAD的高效酶进行了筛选,达到了HBA的高转化率,但产生了HBAM副产物。研究人员发现适量的三磷酸腺苷对该级联反应的产率至关重要。不足浓度的三磷酸腺苷不足以引发级联反应,但过多的三磷酸腺苷加入会对产物的产率产生负面影响。研究者通过从聚磷酸盐再生ATP加强初始ATP输入较低时的级联反应解决了这一问题。

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6AdoCby模块中的反应

接下来,研究人员设计了辅因子再生模块。研究人员设计了一个再生系统来补充SAMNADH、三磷酸腺苷、L-谷氨酰胺和5-丙氨酸,同时减少了无细胞反应系统中副产物的生成。来自枯草芽孢杆菌的谷氨酸脱氢酶RocG被引入来补充CobRHBA途径所需的NADH。谷氨酸棒杆菌的聚磷酸激酶PPK被引入,以外加聚磷酸盐的方式从ADP再生ATP。额外引入了大肠杆菌的2-氧戊二酸脱氢酶复合体OGDH和球形红曲霉的5-氨基乙酰丙酸合成酶HemA,构建了一个完整的NADH5-ALA再生模块。整个辅因子再生模块的引入使AdoCbl的滴度成功增加了一倍。

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7AdoCbl合成系统的辅因子再生系统

最后,研究人员对AdoCbl模块进行了优化。为了避免使用危险的氰化物来转化合成的AdoCbl,研究人员在沸水浴中结合亚硝酸钠、醋酸和E. coli MG1655 (DE3)的粗细胞提取物将AdoCbl转化为CNCbl,而不需要氰化物。研究人员还通过间歇反应体系和增加HBA合成酶相结合、增加HBA途径相关酶的投入量,最终将产率提高到了理论转化率的9.15%。实现了无细胞平台对具有长而复杂生物合成途径的天然化合物的生产。

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